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汪方炜实验室在The EMBO Journal发文揭示有丝分裂期基因组稳定性的重要保护机制

时间:2019年11月27日 访问次数:550

       2019年11月26日,我院汪方炜实验室在国际著名学术期刊The EMBO Journal在線發表了題爲“Histone H2A phosphorylation recruits topoisomerase IIα to centromeres to safeguard genomic stability”的研究論文,揭示了有絲分裂期組蛋白的磷酸化修飾通過招募DNA拓撲異構酶TOP2A保護基因組穩定性的分子機制和功能。

       细胞来自于细胞,产生更多细胞的唯一途径是已存在细胞的分裂。所有生物,包括从单细胞的细菌到多细胞的哺乳动物,都是上溯至30億年前生命起源後連續不斷的細胞生長與分裂的結果。以人體爲例,從一個受精卵發育成人,大約需要經曆30萬億次細胞分裂(Sender R et al., PLoS Biol, 2016)。據粗略估計,一個成年個體每天大約發生500億次有絲分裂。細胞在有絲分裂期的核心任務是准確地分配它在之前的S期複制的染色體,確保每個子細胞得到一份完整的基因組拷貝。這個過程必須高度精確,否則會造成染色體和基因組的穩定性,進而可能導致細胞的癌變。

如圖1所示,在SDNA複制完成後,每條染色體形成兩條相同的姐妹染色單體,它們靠黏連蛋白複合體(Cohesin)和DNA連環(DNA catenation)順著染色體長軸緊密結合在一起。有絲分裂期染色體的分離需要去除姐妹染色單體間的粘連(cohesion)和DNA連環(catenation),這一過程分兩步完成。首先,在有絲分裂的前期和前中期,伴隨著Wapl從染色體臂上移除Cohesin的過程,DNA拓撲異構酶IIαTOP2A)得以去除雙鏈DNA之間的連環和纏繞,從而解除姐妹染色體臂部的物理聯結(Hongtao Yu, Curr Biol, 2013)。在此期間,著絲粒區的CohesinSgo1SororinHaspin等蛋白的保護下逃脫Wapl對其的移除 (Morales C & Losada A, Curr Opin Cell Biol, 2018),並拮抗TOP2ADNA連環的去除作用(Wang L et al., J Cell Sci, 2010; Farcas A et al., Mol Cell, 2011)。隨後,在有絲分裂中期向後期轉換的過程中,隨著蛋白水解酶SeparaseCohesin的剪切,TOP2A須快速高效地去除著絲粒區染色體間的DNA連環,以使得姐妹染色單體及時分離並在紡錘體的牽引下向細胞的兩極移動。


1:有絲分裂期姐妹染色體的分離(左),以及TOP2A(中)和H2ApT120(右)在染色體上的動態分布和定位。

因此,爲了確保有絲分裂期染色體的精確分離,TOP2A必須在染色體分離前就聚集于著絲粒區。事實上,早在二三十年前科學家們就已經發現,TOP2A分布于有絲分裂期染色體的臂部並高度富集于著絲粒區(Earnshaw W et al., J Cell Biol, 1985; Taagepera S et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1993; Rattner J et al., J Cell Biol, 1996)。後續的研究進一步發現,類泛素化修飾促進TOP2A在著絲粒區的定位及姐妹染色體的精確分離(Dawlaty M et al., Cell, 2008)。那麽,TOP2A在著絲粒區定位的受體分子是什麽呢?這個問題的答案一直不爲人們所知。

为了解决这一重要科学问题,亚冠娱乐汪方炜实验室的博士生张妙同学开展了基于RNA幹擾技術的篩選工作,並發現了紡錘體檢查點蛋白Bub1對于TOP2A在着丝粒区定位的重要性(圖2A)。進而,利用小分子化合物抑制Bub1的激酶活性後,TOP2A在着丝粒的定位几乎消失(圖2B),說明Bub1的激酶活性對于TOP2A的著絲粒定位是必需的。

2:敲減Bub1的表達(A)或利用小分子化合物抑制Bub1的激酶活性(B)去除TOP2A在有絲分裂前中期染色體著絲粒區的富集。

已知的Bub1激酶底物有三個,它們分別是紡錘體檢查點蛋白Cdc20Tang Z et al., Mol Cell, 2004; Jia L et al., Nat Commun, 2016)、組蛋白H2AKawashima S et al., Science, 2010)以及端粒蛋白TRF1Li F et al., Mol Cell, 2018)。那麽,Bub1是通過磷酸化哪個已知或未知的蛋白底物發揮作用的呢?張妙同學發現,敲減Cdc20TRF1的表達並不影響TOP2A的著絲粒定位,而TOP2ABub1介導的組蛋白H2A120位蘇氨酸的磷酸化(簡稱H2ApT120)在有絲分裂前期、前中期及中期細胞的著絲粒區有較好的共定位,提示了H2ApT120參與調控TOP2A定位的可能性。接著,張妙同學進行了一系列精巧的實驗操作,將H2ApT120人爲地産生于細胞周期不同時期的染色體的不同區域,發現它都能招募TOP2A至染色體的相應區域,說明H2ApT120TOP2A在著絲粒定位是必要且充分的。繼而,通過在細胞內表達多種不同的TOP2A突變體,張妙同學發現,位于TOP2AC-gate區的coiled-coil結構域和羧基端的ChT结构域對于TOP2A定位于着丝粒区是重要的(圖3)。

3:人源TOP2A蛋白的结构域示意圖。

那麽,H2ApT120TOP2A的招募作用是直接還是間接的呢?爲了解答這個疑問,張妙同學利用林世賢實驗室提供的獨特技術,從一株改造過的大腸杆菌中表達純化了第120位蘇氨酸被替換爲磷酸化的絲氨酸的組蛋白H2A,並在梁材同學的幫助下證實,與野生型的H2A蛋白相比,磷酸化的H2A蛋白與TOP2A蛋白在體外的結合能力明顯增強。

這些實驗結果不僅展示了H2ApT120TOP2A的直接招募作用,而且也爲探究TOP2A在着丝粒區的功能提供了重要的实验手段。通过破坏H2ApT120TOP2A的結合,選擇性地去除TOP2A在着丝粒區的定位而不影响其在染色体臂上的分布,张妙同学发现,着丝粒区姐妹染色体DNA的去連環(decatenation)作用明顯受阻,主要表現爲有絲分裂後期細胞中由超細DNA構成的染色體橋(Ultra-fine anaphase DNA bridges的顯著增加(注:此類染色體橋容易發生DNA損傷)。因此,H2ApT120TOP2A的结合對于解除有丝分裂期姐妹染色单体间的DNA連環是重要的。

這一系列研究結果表明,當細胞進入有絲分裂時,Bub1對组蛋白H2A的磷酸化修飾招募TOP2A至著絲粒,促進著絲粒區DNA连环的去除,进而保证了染色体的精确分离和基因组的稳定性(圖4)。基于TOP2抑制劑在癌症化療中的廣泛應用(John Nitiss, Nat Rev Cancer, 2009),以及近期報道的Bub1小分子抑制剂對于癌细胞增殖的抑制作用(Siemeister G et al., Clin Cancer Res, 2019),這項研究也爲靶向TOP2ABub1的癌症治療提供了新的視角。

4TOP2A在有絲分裂期著絲粒區定位的分子機制及功能。 

汪方炜教授是論文的通訊作者,博士生張妙爲第一作者,汪方炜實驗室的博士生梁材和陳親富以及林世賢實驗室的趙紅霞同學等也有貢獻。此項研究課題受國家重點研發計劃、國家自然科學基金、英國皇家學會牛頓高級學者基金、浙江省自然科學基金、浙江大學校長專項科研基金等的資助。

原文鏈接:https://www.embopress.org/doi/10.15252/embj.2019101863